Host Cell Proteine (HCPs)
Bei der Herstellung von Biopharmazeutika wird meist Zellkultur verwendet. Die Wirtszellen (engl. host cells) exprimieren nicht nur den eigentlichen Wirkstoff, sondern auch viele andere Proteine, die als Wirtszellproteine (engl. Host Cell Proteins) bezeichnet werden. Diese können die Wirksamkeit des Wirkstoffs beeinträchtigen und potentiell gefährlich für den Menschen sein. Daher müssen die Grenzwerte der HCPs nach der Aufreinigung des Produkts qualifiziert und quantifiziert werden.
Um geringe Mengen detektieren zu können, ist die 2D-Elektrophorese mit anschließendem Immuno-Blotting eine Möglichkeit. Mit dem horizontalen Elektrophoresesystem und blotbaren Fertiggelen von SERVA steht Ihnen ein hochauflösendes und leistungstarkes Komplettpaket zur Verfügung.
Probenvorbereitung
Die meisten kommerziell erhältlichen Aufreinigungskits für die 2D Elektrophorese sind Bind-Wash-Elute Säulchen. Diese sind teuer, verursachen viel Plastikmüll und bedingen immer einen Proteinverlust. Bei vielen / unterschiedlichen Verunreinigungen empfehlen wir daher die Proteinfällung nach Wessels & Fluegge. Diese entfernt alle Verunreinigungen und schützt die Probe. Für die Fällung bieten wir Methanol und Chloroform an.
Die erste Dimension der 2D Elektrophorese (isoelektrische Fokussierung) ist besonders salzempfindlich. Wenn die Probe keine Aufreinigung benötigt, aber einen hohen Salzgehalt aufweist (häufig verursacht durch Nähr- und Waschmedien der Zellkultur), empfehlen wir die X-Spinner Ultrafiltrations-Konzentratoren. Das einzigartige Design der Proteus X-Spinner Ultrafiltrations-Konzentratoren ermöglicht die Ultrafiltration in entgegengesetzter Richtung zur Zentrifugalkraft, wodurch der Proteinverlust minimiert wird.
2D Elektrophorese
1. Dimension
In der isoelektrischen Fokussierung werden die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt. Hierzu verwendet man Gelstreifen mit Immobilisierten pH-Gradienten (IPG Streifen). Passend zu den Ansprüchen an die Auftrennung Ihrer Probe und je nach Wahl des Gelformats (mini-midi-large), bieten wir fünf verschiedene Längen (7 cm – 24 cm) mit je sechs unterschiedlichen pH Gradienten an. Klicken Sie hier für eine Übersicht.
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Zur Fokussierung der Streifen wird eine hohe Spannung benötigt. Andere Hersteller bieten hochpreisige Streifenfokussierer an. Unser Workflow soll einfach für den Kunden sein und trotzdem die besten Ergebnisse erzielen.
Durch den HPE™ Elektrodendeckel mit Tray für IPG Streifen und den BluePower™ 6000 IPG Stromversorger erweitern Sie Ihre HPE™ BlueHorizon™ zu einer Fokussierungseinheit. |
2. Dimension
In der SDS PAGE werden die Proteine nach ihrer Molmasse aufgetrennt. Besonders in der 2D Elektrophorese ist die Spotschärfe wichtig für eine gute Auswertung. Im Vergleich zu vertikalen Gelen, die meist eine Dicke über 0,75 mm haben, ist die Spotschärfe gekühlter und ultradünner Horizontalgele um ein vielfaches besser. Damit die Gele nicht reißen, sind sie auf einer Trägerfolie aufgebracht.
Die beste Kammer für diese Gele ist die HPE™ BlueHorizon™. Eine Keramikkühlplatte, unzerstörbare Elektroden und die Stapelbarkeit sind nur drei der vielen Vorteile.
Horizontale, foliengestützte Gele haben den Nachteil, dass sie nicht blotbar sind. Um das Gel von der Folie abzuschneiden, arbeitete man früher mit einer 2 Liter Flasche und einer Angelschnur. Wir haben blotbare Gele entwickelt, die nur an schmalen, definierten Stellen kovalent an der Folie haften (Abb.: rote Streifen). Mit einem Skalpell trennt man diesen Streifen ab und kann danach das Gel abziehen. Um zu vermeiden, dass das Gel reißt, empfiehlt sich den Blot upside-down aufzubauen.
Die 2D HPE™ BlotGele gibt es in drei Versionen für kurze, mittellange und lange IPG Streifen. Die Folie ist nicht fluoreszierend. Es ist also möglich die separierte Probe nach der Elektrophorese und vor dem Blot-Aufbau mit Fluoreszenzfarbstoffen oder -label zu detektieren.
Tipp: Labeln Sie bereits vor der ersten Dimension mit Fluoreszenz, dann kann vor dem Blotten die Elektrophoresequalität überprüft werden. Das ist nachhaltig und spart Geld. Wir empfehlen die NHS-Ester von SERVA: SERVA Lightning SciDye Set
2D Western Blotting
Mit den 2D HPE™ BlotGelen ist das Blotten horizontaler Gele unkompliziert. Ein kleiner Schnitt mit dem Skalpell und schon lässt sich das Gel von der Folie abziehen.
Am einfachsten geht dies mit dem BlueBlot Semi-Dry blotter. Durch die komplett herausnehmbaren Elektroden ist der upside-down Aufbau viel einfacher als mit einer Glasplatte. Nachdem alles Luftblasen-frei gestapelt wurde flippt man das Sandwich zwischen den Elektroden und setzt alles in den Blotter ein. Ein von uns eigens entwickelter Verschluss hält den Blot fest und presst ihn leicht an. Ein Beschweren des Deckels gehört der Vergangenheit an.
Da man große Gele blottet, benötigt man auch einen Ampere-starken Stromgeber. Der BluePower™ 300 BLOT liefert ausreichend Strom für ein perfektes Blot-Ergebnis.
Antikörperdetektion
Um unspezifische Bindungsstellen für Ihre Antikörper abzublocken empfehlen wir das Protein-freie Blocking Reagenz BlueBlock PF. Ein weiterer Vorteil ist, dass es ebenfalls zur Verdünnung Ihres HCP-Erstantikörpers und des anti-IgG-HRP Zweitantikörpers verwendet werden kann.
Zur Chemilumineszenz-Detektion haben Sie bei SERVA die Wahl zwischen klassischen A/B-Lösung-Substraten oder ready-to-use Pre-Mixen. Die jeweiligen SERVALight-Substrate unterscheiden sich in Lichtintensität und -dauer.
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