SERVA Western Blotting

SERVA Western Blotting Workflow

Western Blotting Workflow

Nach der Elektrophorese

Nachdem Sie Proteine mittels Elektrophorese getrennt haben, werden diese durch Elektrotransfer auf eine Membran übertragen. Entweder verwenden Sie einen Tank-Blotter und den Towbin Puffer für kleine Proteine, oder bei einer Mischung aus kleinen und großen Proteinen oder nach einer isoelektrischen Fokusierung ein Semi-Dry-Blotter mit einem diskontinuierlichen Puffersystem. Eine weitere Alternative ist der von SERVA entwickelte Xpress Blotting Kit.

Blotting-Membranen

Obwohl Nitrozellulose-Membranen immer noch häufig eingesetzt werden, erhalten Sie bessere Transferergebnisse mit PVDF-Membranen. Außerdem sind Nitrozellulose-Membranen spröde und erschweren Ihnen die Handhabung. Dies vermeiden Sie mit unseren vliesverstärkten Nitrozellulose-Membranen.

Nachweis

Nach dem Transfer können Sie die Proteine direkt mit kolorimetrischen Farbstoffen sichtbar machen. Eine weitere Möglichkeit ist der Nachweis mittels gebundenen Antigenen (Immunoblotting). Hierbei ist die passende Blockierungslösung der Weg zum Erfolg, wenn Sie den Nachweis über eine Chemilumineszenz Reaktion durchführen möchten.

Protein Standard für das Western Blotting

SERVA VisiBlot Standard I

Der SERVA VisiBlot Standard I ist eine gebrauchsfertige Mischung rekombinanter Proteine im Molekulargewichtsbereich von 25 kDa bis 150 kDa. Damit Sie den Marker während der Elektrophorese sehen können und eine Transferkontrolle haben, sind drei Proteinbanden vorgefärbt.

Zusätzlich sind fünf ungefärbte Proteine enthalten, die IgG-Bindungsstellen besitzen. Daher sind diese über die Antikörperdetektion auf der Blot-Membran nachweisbar und erlauben Ihnen die genaue Zuordnung des Molekulargewichts.

Blotting Puffer und Kits

Xpress Blotting Kits

Neben dem Towbin Puffer für kleine Proteine und dem diskontinuierlichen Puffersystem haben wir für Sie verschiedene Xpress Blotting Kits entwickelt. Jeder Kit enthält gebrauchsfertigen Puffer und Blottingvliese. Zum einen verringert der Puffer die Transferzeit auf 15 Minuten, zum anderen vermindern die neu entwickelten Blottingvliese Störungen beim Transfer.

Entscheiden Sie sich für das Kit ohne Membranen um Ihre eigenen Membranen weiter verwenden zu können oder wählen Sie ein Kit mit vorgeschnittenen NC- oder PVDF- Membranen.

Transfer Membranen

Nitrozellulose Membranen

Nitrozellulose-Membranen sind für Western,  Southern und Northern Blots geeignet. Der Grund dafür ist die hohe Bindungskapazität und ein geringer Hintergrund. Vor allem die vliesverstärkten Nitrozellulose-Membranen sind eine gute Alternative, da das Zerschneiden einfacher, mehrfache Hybridisierungen und automatische Immobilisierung möglich ist.

Nylon-Bind Membrane

Nylon-Bind-Membranen zeichnen sich durch eine hohe Dehn- und Zugfestigkeit, einen geringen Hintergrund bei hoher Sensitivität und einer hohen Bindungskapazität aus. Des weiteren garantiert ihre einheitlich stark positiv geladene mikroporöse Oberfläche die schnelle und effiziente Bindung von Proteinen aber vor allem von Nukleinsäuren.

Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membrane

PVDF-Membranen sind hydrophob, haben eine exzellente mechanische Stabilität, sind hoch flexibel und reißfest. Zusätzlich besitzen sie eine hohe Bindungskapazität und zeigen einen geringen Hintergrund. Des weiteren sind sie kompatibel mit den meisten Färbemethoden. Demnach empfehlen wir Fluorobind- Membranen um Proteine mit Immundetektion oder Fluoreszenz nachzuweisen.

Blocking Reagenzien

BlueBlock PF

Um ein gutes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu erreichen, ist es wichtig auf der Transfermembran unspezifische Antikörper-Bindungsstellen zu blockieren.

Dennoch besteht bei Protein-enthaltenden Blockierungslösungen, wie Magermilchpulver oder BSA, die Gefahr, dass nicht nur unspezifische Antikörper-Bindungsstellen blockiert, sondern auch spezifische Bindungsstellen maskiert werden. Im Gegensatz dazu werden mit BlueBlock PF nur die unspezifischen Bindungen unterdrückt, während die spezifischen Bindungsstellen erhalten bleiben. Dadurch wird die Signalstärke erhöht.

Chemilumineszenz Substrate

SERVALight CL HRP Substrate

SERVA führt fünf verschiedene ready-to-use Chemilumineszenz Kits. Damit weisen Sie immobilisierte Proteine (Western Blot) oder Nukleinsäuren (Southern und Northern Blot) entweder direkt mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder indirekt mit HRP-markierten Antikörpern/Streptavidin nach.

Die SERVALight CL HRP Substrate sind schnell hergestellt. Dazu mischen Sie Komponente A (Luminol/Verstärker-Lösung) und Komponente B (stabilisierte Peroxidlösung) in einem Verhältnis von 1:1.

 

Stärke des Anfangsignals (Detektionslimit):

Vega (mid picogram)
Polaris (low picogram)
Eos (mid femtogram)
Eos Ultra (mid to low femtogram)
Helios (low femtogram)

Geräte rund um das Blotting

BlueBlot Semi-Dry-Blotter

Der BlueBlot Semi-Dry-Blotter liefert ein besonders homogenes elektrisches Feld, das für einen schnellen und effizienten Transfer der Proteine vom Gel auf die Membran sorgt. Im Vergleich zum Tankblotverfahren entsteht bei dieser Methode wesentlich weniger Wärme.

Anode und Kathode bestehen aus platinierten Stahlnetzen. Zusätzlich erlaubt die federnd gelagerte Anode das Blotten von dickeren Gelen oder von Gelstapeln. Nicht nur das stabile Gehäuse aus Acryl ist leicht zu reinigen, auch die langlebigen Elektroden nehmen Sie mit einem Handgriff aus dem Gehäuse und reinigen diese unter dem Wasserhahn.

Wählen Sie aus drei Größen aus. Das Model SD11 bietet Platz für ein, der SD17 für vier und der SD26 für sechs Minigele.

GeneGnome XRQ

Der GeneGnome XRQ ist ein bildgebendes System für Chemilumineszenz. Zu diesem Zweck ist er mit einer hohen Leistung und Automatisierung ausgestattet. Zum Beispiel ermöglicht die hocheffiziente CCD-Kamera eine noch sensitivere Aufnahme und der einfache Einstellungsprozess startet die Aufnahme eines Qualitätsbildes jedes Westernblots automatisch. Durch eingebaute Weißlicht-LEDs können gefärbte Marker abgebildet werden.

Gravity Blotter

Der SERVA Gravity Blotter wurde von SERVA für das Blotten mit hoher Effizienz von Film-basierten IEF- und SDS PAGE-Gelen entwickelt. Wenn eine horizontale Gelelektrophorese durchgeführt wird, muss die Gelschicht entweder durch eine Glasplatte oder eine Plastikfolie gestützt werden. Bevor die Proteine durch Tank- oder Semi-Dry-Blotting auf eine Membran transferiert werden können, muss die Stützfolie entfernt werden. Während dieses Prozesses kann das Gel beschädigt werden. Durch den Einsatz des Gravity Blotters ist es nicht mehr nötig das Gel von der Stützfolie abzutrennen. Die erzielten Ergebnisse sind mit den Tank- oder Semi-Dry-Transfermethoden vergeichbar.
Die Einheit besteht aus einer Basisplatte mit einer Transferfläche von 14 x 29 cm. Der Druck wird durch Aluminiumplatten, die auf den Blotstapel gelegt werden, erzeugt. Die Transferzeit ist 4 Stunden oder über Nacht.

SERVA Musketeer

Das Geldokumentatiossystem SERVA Musketeer ist für manigfaltige Aufgaben in der Geldokumentation einsetzbar: Chemilumineszenz, Fluoreszenz und sichtbares Licht im Auflicht und Durchlicht, UV. Die Handhabung ist intuitiv. Kernstück ist eine kühlbare CCD-Kamera (-55 °C +/- 5 °C Umgebungstemperatur, 16 bit, 6X6 Binning) mit Autofokus-Objektiv (f=0.95) und automatischem Filterwechsel.

Das System arbeitet unabhängig und benötigt keinen separaten PC. Als zentrales Bedienelement dient ein Touchscreen, mit dem sich alle Applikationen steuern lassen. So lassen sich schnell und einfach Aufnahmen von Gelen, Westernblots etc. erstellen und abspeichern. Die Daten können anschießend bei Bedarf einfach über eine USB-Port ausgelesen werden.

Ausgestattet ist das SERVA Musketeer mit einem UV, einem Weißlicht sowie einem Rot/Grün/Blau (R/G/B)-LED-Transilluminator und R/G/B- und Weißlicht-Auflicht einschließlich der passenden Filter. Damit kann eine Vielzahl von Anwendungen abgedeckt werden: Dokumentation von Nukleinsäuregelen mit EtBr oder SERVA DNA Clear G (oder verwandten Fluoreszenzfarbstoffen), Proteine gefärbt mit Coomassie® im VIS-Bereich oder mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert wie z.B. das Prestain SERVA PRiME Lightning Red, Chemilumineszenzaufnahmen von Western Blots (SERVA Vega ECL, SERVA SciDyes und ähnlichen CL-Substraten).

YouTube Videos

Transfer Methods – Blotting Basics

Greetings from Outer Space

Speed up your blotting I

Troubleshooting Western Blot

Speed up your blotting II